Doctorado - Unidad de Proteómica (UCM-PCM)

> "PROTEÓMICA"

Departemanto de Bioquímica y Biología Molecular I, II, III y IV.
Impartido en la Facultad de Ciencias Químicas
https://alamo.sim.ucm.es/doctorado/programa.asp?id=179#dep

Profesores
Fernándo Vivando Martínez

Temario

1.-Introducción a la proteómica. Factores que condicionan la aparición de la proteómica. Concepto de proteoma. Complementaridad de proteómica y genómica. Una visión holística de la nueva biología.

2.- Tipos de estudios proteómicos: 1) Determinación de proteomas y subproteomas celulares. 2) Proteoma de expresión diferencial. Implicaciones en patología. 3) Proteómica de mapa celular: caracterización de interacciones proteína-proteína (mapas de interacción). Complejos macromoleculares y rutas de interacción.

3.- Técnicas de separación masiva de proteínas en Proteómica. 1) Electroforesis bidimensional (2-D). 2) Electroforesis capilar. 3) Cromatografia Multidimensional.

4.- Electroforesis bidimensional. I. Solubilización de muestras:objetivos y criterios. Roturas de puentes disulfuro: agentes reductores. Rotura de enlaces no covalentes: agentes caotropos, detergentes, surfactantes y otros aditivos solubilizadores; anfolitos. Eliminación de compuestos que interfieren en la solubilización: lípidos, sales, polianiones.

5.- Electroforesis bidimensional. II. Solubilización de proteínas de Membrana. Obtención de subproteomas (fraccionamiento subcelular). Solubilización diferencial. Preparación de muestras de diversos orígenes (microorganismos, células animales, células vegetales, cultivos celulares, fluidos biológicos). Microdisección por captura con laser.

6.- Electroenfoque. Fundamentos. Formación de gradientes en solución (anfolitos) e inmovilizados (inmovilinas). IPGs. Gradientes de pH extendidos y expandidos. Gradientes básicos. Aplicación de la muestra: modalidades, solubilización. Cubetas de electroenfoque. Programas automatizados de desarrollo del electroenfoque. PAGE-SDS. Concepto y desarrollo.

7.- Detección de proteínas en gels 2-D. Tinción con colorantes orgánicos (Coomassie/Coloidal). Detección por precipitación diferencial de sales. Tinción con plata. Desarrollo del método. Detección con compuestos fluorescentes (Cy3/Cy5, Sypro). Detección con compuestos radiactivos. Estudio comparativo de los diversos métodos.

8.- Análisis de imagen de geles 2-D. Utilización de los programas Melanie, PDQest, ImageMaster, Otros. Creación de geles virtuales. El Sistema DIGE.

9.- Digestión de proteínas in situ (gel) para su análisis por espectrometría de masas (EM). Selección de enzimas. Digestión con tripsina. Protocolo de digestión. Extracción y purificación de péptidos tripticos. Digestión de proteínas en solución.

10.- Fundamentos de la Espectrometria de Masas (EM). Componentes de un espectrómetro. Combinación de componentes y tipos de espectrómetros.

11.- Métodos de ionización. Electrospray (electronebulización): concepto y formación de iones. Microspray y nanospray. Ventajas e inconvenientes. Desorción e ionización mediante laser inducida por matriz (MALDI). Ventajas e inconvenientes. Tipos de matrices.

12.- Parámetros fundamentales del análisis de masas (m/z). Resolución. Cluster de Isotopos. Intervalo de masas (m/z). Cálculo del número de cargas de un ion (péptidos). Exactitud y precisión en las medidas de masas. Factores que afectan a la exactitud de masas. Expresión de la exactitud. Análisis a unidad de resolución.

13.- Analizadores de masas. Cuadrupolos y hexapolos. Análisis de masas (m/z) con cuadrupolos. Barridos y adquisición de espectros. Los cuadrupolos como lentes. Intervalos de m/z. Resolución y Sensibilidad.

14.- Trampa Iónica. Fundamentos. Fuentes de ionización. Ciclo de trabajo y modalidades de actuación. Resolución y sensibilidad. Intervalo de análisis de m/z.

15.- Análisis de masas (m/z) mediante el tiempo de vuelo (TOF) . Fundamento. Cálculo de masas mediante el tiempo de vuelo. Resolución y sensibilidad. Factores que afectan a la resolución. Extracción retardada. Espejos iónicos (reflectron).

16.- Espectrometria de masas en tandem. Fundamentos. Disociación inducida por colisión (CID). Instrumentos en tandem en el espacio (Triple cuadrupolo, Q-TOF, TOF-TOF) y en el tiempo (Q-Trampa iónica, FT-ICR). Modos de análisis de masas por EM en tandem: iones producto, iones precursores, pérdidas neutras.

17.- CID de péptidos protonados. Química de la fragmentación de péptidos en fase gaseosa. CID de péptidos formados por EI. Hipótesis del protón móvil. Fragmentación dirigida por la carga. Rutas de rotura. Efectos de la Pro y el Asp. Tipos de iones producidos (a,b,c;x,y,z). Otros iones. Nomenclatura. Iones imonio. Roturas de alta energia (iones d,e, w).

18.- Fragmentación de péptidos protonados generados por MALDI. Análisis de PSD.

19.- Interpretación de espectros de iones producto de péptidos trípticos. Valores tabulados usados en la interpretación. Estrategia para la interpretación de espectros en seis pasos. Casos prácticos de interpretación de espectros característicos. Introducción a la secuenciación de novo. Estrategias de secuenciación.

20.- Análisis de masas de digeridos trípticos mediante HPLC. Diseño experimental. Desalado y purificación de muestras. Adquisición de espectros de masas y de iones producto (fragmentos). Análisis de muestras complejas mediante cromatografia líquida multidimensional. El método ICAT. Otros métodos cuantitativos.

21.- Identificación de proteínas mediante búsquedas en las bases de datos. Bases de datos de secuencias. Programas de búsqueda utilizando masas moleculares de péptidos (huella péptidica). Programas de búsqueda utilizando datos de fragmentación y secuencia (MS/MS) de péptidos obtenidos por EM.

22.- Identificación de modificaciones postraduccionales (PTM) mediante EM. Identificación de PTM a partir de determinaciónes de masas y mediante reacciones de fragmentación de péptidos. Aplicación a fosforilación y glicosilación. Otras modificaciones.

23.- Caracterización de Complejos proteicos. Técnicas de captura mediante cromatografia de afinidad y en tandem (TAP). Programas de búsqueda e identificación de interacciones proteína-proteína.

24.- Proteómica Clínica. El proteoma del plasma humano. Obtención de perfiles proteicos. Identificación de Biomarcadores. Arrays de Proteínas. Arrays en fase reversa. El Sistema SELDI y otros sistemas de obtención de perfiles. Estudio de tejidos mediante espectrometría de masas (“MS Imaging”): mapas bidi- y tridimensionales proteicos de tejidos. Localización de fármacos en tejidos mediante espectrometría de masas.

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	> "PROTEÓMICA" Departemanto de Bioquímica y Biología Molecular I, II, III y IV. Impartido en la Facultad de Ciencias Químicas https://alamo.sim.ucm.es/doctorado/programa.asp?id=179#dep Profesores Fernándo Vivando Martínez Temario 1.-Introducción a la proteómica. Factores que condicionan la aparición de la proteómica. Concepto de proteoma. Complementaridad de proteómica y genómica. Una visión holística de la nueva biología. 2.- Tipos de estudios proteómicos: 1) Determinación de proteomas y subproteomas celulares. 2) Proteoma de expresión diferencial. Implicaciones en patología. 3) Proteómica de mapa celular: caracterización de interacciones proteína-proteína (mapas de interacción). Complejos macromoleculares y rutas de interacción. 3.- Técnicas de separación masiva de proteínas en Proteómica. 1) Electroforesis bidimensional (2-D). 2) Electroforesis capilar. 3) Cromatografia Multidimensional. 4.- Electroforesis bidimensional. I. Solubilización de muestras:objetivos y criterios. Roturas de puentes disulfuro: agentes reductores. Rotura de enlaces no covalentes: agentes caotropos, detergentes, surfactantes y otros aditivos solubilizadores; anfolitos. Eliminación de compuestos que interfieren en la solubilización: lípidos, sales, polianiones. 5.- Electroforesis bidimensional. II. Solubilización de proteínas de Membrana. Obtención de subproteomas (fraccionamiento subcelular). Solubilización diferencial. Preparación de muestras de diversos orígenes (microorganismos, células animales, células vegetales, cultivos celulares, fluidos biológicos). Microdisección por captura con laser. 6.- Electroenfoque. Fundamentos. Formación de gradientes en solución (anfolitos) e inmovilizados (inmovilinas). IPGs. Gradientes de pH extendidos y expandidos. Gradientes básicos. Aplicación de la muestra: modalidades, solubilización. Cubetas de electroenfoque. Programas automatizados de desarrollo del electroenfoque. PAGE-SDS. Concepto y desarrollo. 7.- Detección de proteínas en gels 2-D. Tinción con colorantes orgánicos (Coomassie/Coloidal). Detección por precipitación diferencial de sales. Tinción con plata. Desarrollo del método. Detección con compuestos fluorescentes (Cy3/Cy5, Sypro). Detección con compuestos radiactivos. Estudio comparativo de los diversos métodos. 8.- Análisis de imagen de geles 2-D. Utilización de los programas Melanie, PDQest, ImageMaster, Otros. Creación de geles virtuales. El Sistema DIGE. 9.- Digestión de proteínas in situ (gel) para su análisis por espectrometría de masas (EM). Selección de enzimas. Digestión con tripsina. Protocolo de digestión. Extracción y purificación de péptidos tripticos. Digestión de proteínas en solución. 10.- Fundamentos de la Espectrometria de Masas (EM). Componentes de un espectrómetro. Combinación de componentes y tipos de espectrómetros. 11.- Métodos de ionización. Electrospray (electronebulización): concepto y formación de iones. Microspray y nanospray. Ventajas e inconvenientes. Desorción e ionización mediante laser inducida por matriz (MALDI). Ventajas e inconvenientes. Tipos de matrices. 12.- Parámetros fundamentales del análisis de masas (m/z). Resolución. Cluster de Isotopos. Intervalo de masas (m/z). Cálculo del número de cargas de un ion (péptidos). Exactitud y precisión en las medidas de masas. Factores que afectan a la exactitud de masas. Expresión de la exactitud. Análisis a unidad de resolución. 13.- Analizadores de masas. Cuadrupolos y hexapolos. Análisis de masas (m/z) con cuadrupolos. Barridos y adquisición de espectros. Los cuadrupolos como lentes. Intervalos de m/z. Resolución y Sensibilidad. 14.- Trampa Iónica. Fundamentos. Fuentes de ionización. Ciclo de trabajo y modalidades de actuación. Resolución y sensibilidad. Intervalo de análisis de m/z. 15.- Análisis de masas (m/z) mediante el tiempo de vuelo (TOF) . Fundamento. Cálculo de masas mediante el tiempo de vuelo. Resolución y sensibilidad. Factores que afectan a la resolución. Extracción retardada. Espejos iónicos (reflectron). 16.- Espectrometria de masas en tandem. Fundamentos. Disociación inducida por colisión (CID). Instrumentos en tandem en el espacio (Triple cuadrupolo, Q-TOF, TOF-TOF) y en el tiempo (Q-Trampa iónica, FT-ICR). Modos de análisis de masas por EM en tandem: iones producto, iones precursores, pérdidas neutras. 17.- CID de péptidos protonados. Química de la fragmentación de péptidos en fase gaseosa. CID de péptidos formados por EI. Hipótesis del protón móvil. Fragmentación dirigida por la carga. Rutas de rotura. Efectos de la Pro y el Asp. Tipos de iones producidos (a,b,c;x,y,z). Otros iones. Nomenclatura. Iones imonio. Roturas de alta energia (iones d,e, w). 18.- Fragmentación de péptidos protonados generados por MALDI. Análisis de PSD. 19.- Interpretación de espectros de iones producto de péptidos trípticos. Valores tabulados usados en la interpretación. Estrategia para la interpretación de espectros en seis pasos. Casos prácticos de interpretación de espectros característicos. Introducción a la secuenciación de novo. Estrategias de secuenciación. 20.- Análisis de masas de digeridos trípticos mediante HPLC. Diseño experimental. Desalado y purificación de muestras. Adquisición de espectros de masas y de iones producto (fragmentos). Análisis de muestras complejas mediante cromatografia líquida multidimensional. El método ICAT. Otros métodos cuantitativos. 21.- Identificación de proteínas mediante búsquedas en las bases de datos. Bases de datos de secuencias. Programas de búsqueda utilizando masas moleculares de péptidos (huella péptidica). Programas de búsqueda utilizando datos de fragmentación y secuencia (MS/MS) de péptidos obtenidos por EM. 22.- Identificación de modificaciones postraduccionales (PTM) mediante EM. Identificación de PTM a partir de determinaciónes de masas y mediante reacciones de fragmentación de péptidos. Aplicación a fosforilación y glicosilación. Otras modificaciones. 23.- Caracterización de Complejos proteicos. Técnicas de captura mediante cromatografia de afinidad y en tandem (TAP). Programas de búsqueda e identificación de interacciones proteína-proteína. 24.- Proteómica Clínica. El proteoma del plasma humano. Obtención de perfiles proteicos. Identificación de Biomarcadores. Arrays de Proteínas. Arrays en fase reversa. El Sistema SELDI y otros sistemas de obtención de perfiles. Estudio de tejidos mediante espectrometría de masas (“MS Imaging”): mapas bidi- y tridimensionales proteicos de tejidos. Localización de fármacos en tejidos mediante espectrometría de masas. Volver