1.
CORTE DE LAS MANCHAS:
Cortar
las bandas o manchas con una hoja de bisturí o con una
punta de pipeta recortada y depositar cada una en un pocillo
de una placa de 96 pocillos o en tubos eppendorf.
2. LAVADO:
Realizar
2 lavados con agua milli-Q durante 10 min.
3. DESHIDRATACIÓN:
Añadir
acetonitrilo (AcN) hasta que cubra la banda o mancha (20 ml)
y esperar 5 min para que el gel se deshidrate y libere el colorante.
Repetir esta operación dos veces para que el gel quede
más o menos blanco.
4. SECAR A VACÍO EN CENTRÍFUGA "SPEED-VAC".
5. REDUCCIÓN Y ALQUILACIÓN
1.
Cubrir las bandas con una solución 10 mM Di-tio-treitol
(DTT) en bicarbonato amónico 25 mM (NH4HCO3 ), 30 min
a 56°C.
2. Dejar a temperatura ambiente, eliminar el DTT y añadir
AcN que se retira rápidamente para incubar con Iodoacetamida
55mM (10 mg /ml) en 25 mM NH4HCO3 durante 15 min en oscuridad.
6.
LAVADO
1.
Incubar 5 min con AcN y retirarlo.
2. Añadir NH4HCO3 25 mM e incubar 5 min tras los cuales
sin retirar el sobrenadante se añade igual volumen de
AcN y se incuba 15 min.
3. Retirar el sobrenadante.
7. SECAR A VACÍO EN CENTRÍFUGA "SPEED-VAC"
8. DIGESTIÓN
1.
Añadir tripsina en una concentración de 12,5 ng/ml
en 25 mM de NH4HCO3 y en un volumen que cubra bastante por encima
las bandas que ahora están deshidratadas. Incubar en
hielo 45 min para que se absorba pero sin que llegue a actuar.
2. Retirar el sobrenadante y añadir NH4HCO3 25 mM hasta
cubrir las bandas.
3. Incubar toda la noche a 37°C (o al menos 6 horas).
4. Tras la digestión agitar con vortex y centrífugar
para pasar el sobrenadante a una nueva placa o tubos.
9. EXTRACCIÓN DE PÉPTIDOS
1.
Cubrir las bandas con 50% AcN /0.5% ácido trifluoroacético(TFA)
y sonicar 10 min. Pasar el sobrenadante a otro tubo o placa.
Repetir 3 veces esta operación recogiendo todos los sobrenadantes
de cada extracción juntos.
2. Realizar otras tres extracciones con AcN de 10 min cada una
y depositar los sobrenadantes junto con los de las tres extracciones
anteriores.
10. JUNTAR TODOS LOS SOBRENADANTES
Secar
en centrífuga "speed-vac" y resuspender en
5 ml de 50% AcN en 0.1% TFA.
