1.
CORTE DE LAS MANCHAS
Cortar
las bandas o manchas con una hoja de bisturí o con una
punta de pipeta recortada y depositar cada una en un pocillo
de una placa de 96 pocillos o en tubos eppendorf.
2. LAVADO
Realizar 2 lavados con agua mili-Q durante 10 min.
3.
DESTEÑIDO
Cubrir
las bandas con la solución de desteñido e incubar
10 min.
Solución de desteñido: 30 mM de ferrocianuro potásico
(9.9 mg/ml) y 100 mM de tiosulfato sódico (24.8 mg/ml).
4. LAVADO
Con
agua milli-Q para retirar la solución de desteñido.
5. DESHIDRATACIÓN
Añadir
acetonitrilo (AcN) hasta que cubra la banda o mancha (20 ml)
y esperar 5 min para que el gel se deshidrate y libere el colorante.
Repetir esta operación dos veces para que el gel quede
más o menos blanco.
6. SECAR A VACÍO EN CENTRÍFUGA "SPEED-VAC"
7.
REDUCCIÓN Y ALQUILACIÓN
1.
Cubrir las bandas con una solución 10 mM Di-tio-treitol
(DTT) en bicarbonato amónico 25 mM (NH4HCO3 ), 30 min
a 56°C.
2.
Dejar a temperatura ambiente, eliminar el DTT y añadir
AcN que se retira rápidamente para incubar con Iodoacetamida
55mM (10 mg /ml) en 25 mM NH4HCO3 durante 15 min en oscuridad.
